Nasce a Roma, in Via delle Convertite 21, il 16 novembre 1899, in una famiglia di agiati ebrei toscani. Trasferitosi a Firenze, inizia ad entrare in contatto con l'ambiente socialista. Milita nelle file interventiste. Il fratello Aldo, più grande di lui, parte volontario e nel 1916 muore sul fronte, sui monti della Carnia. Partecipa anche lui alla prima guerra mondiale, come sottotenente, chiedendo di essere assegnato agli Alpini, e già al fronte matura la sua adesione al socialismo. Finita la guerra, riprende gli studi di scienze politiche e conosce Gaetano Salvemini, dal quale è fortemente influenzato. Nel '21 si laurea in scienze politiche con la tesi "Il sindacalismo". Esce dal Partito Socialista dopo il XIX congresso che sancisce l’espulsione dei riformisti di Treves, Turati e Matteotti, Rosselli si schiera con la corrente riformista che dà luogo al partito socialista unitario.Conosce Piero Gobetti e il gruppo di giovani intellettuali che pubblicano il settimanale “La Rivoluzione Liberale”.

Prende parte alla ristretta attività del Circolo di Cultura fiorentina, promosso da Gaetano Salvemini, Piero Calamandrei, Ernesto Rossi, Ludovico Limentani, Piero Jahier e l’avv. Alfredo Nicoli, nel cui studio si tenevano le riunioni.
Già dei primi anni Venti è l'idea di un socialismo che può salvarsi solo affrancandosi dal marxismo e adottando il metodo liberale. Rosselli, insieme al fratello Nello e all'amico Ernesto Rossi, frequenta assiduamente Gaetano Salvemini, considerato dai tre il loro comune maestro.
Nel 1924, all’indomani del delitto Matteotti si iscrive al partito socialista unitario.
Nel '25 fonda con il fratello Nello, Salvemini ed Ernesto Rossi il bollettino clandestino “Non Mollare”, che manda su tutte le furie Mussolini. Pubblica anche diversi memoriali sul delitto Matteotti che scuotono l’opinione pubblica nazionale. Casa Rosselli é devastata dai fascisti.
Non passa molto tempo che Rosselli insieme a Parri ed a Bauer costituisce un’organizzazione per l’espatrio di molti leader antifascisti e nel '27 viene arrestato insieme a Parri per l’espatrio di Turati. Rosselli viene condannato a 5 anni di confino a Lipari per l’intervento diretto di Mussolini.
Nel 1929, al confino di Lipari dove lo ha spedito il fascismo, Rosselli scrive Socialismo liberale (lo farà uscire l'anno dopo, una volta rifugiato a Parigi), in cui teorizza un nuovo socialismo, epurato dal marxismo.

Nel novembre del 1929, a Parigi, dove nel frattempo è riuscito a rifugiarsi, Carlo Rosselli, Emilio Lussu e i fuoriusciti riuniti intorno alla figura di Gaetano Salvemini fondano un movimento, «Giustizia e Libertà», che vuole essere «l'anima della rivoluzione liberatrice di domani»: un movimento rivoluzionario libertario e democratico che riunisce in Italia e all'estero coloro che non sono comunisti, avversano i gruppi dirigenti liberali e la sinistra aventiniana e vogliono combattere il regime fascista per creare una società libera e civile. E' Salvemini a stendere la bozza di statuto. I costituenti hanno storie politiche diverse: liberali come Tarchiani, il giornalista Alberto Cianca e Vincenzo Nitti; repubblicani come Cipriano Facchinetti, Raffaello Rossetti, Gioacchino Dolci e Fausto Nitti; socialista come Rosselli, sardisti come Lussu. Il motto è suggerito da Lussu: "Insorgere! Risorgere!".
Adottano per simbolo la spada di fiamma tra quelle due parole. "Provenienti da diverse correnti politiche - si legge nel primo appello di GL, diffuso a novembre del 1929 - archiviamo per ora le tessere e creiamo un’unità d'azione". La guida del movimento è affidata a un triumvirato espressivo delle tendenze su cui GL si fonda: Rosselli socialista, Lussu sardista-repubblicano,Tarchiani liberale.
Il movimento si dota presto di una rivista come strumento di elaborazione teorica: i ‘Quaderni di Giustizia e Libertà’.
A partire dal 1934 Carlo Rosselli imprime una svolta nel suo pensiero e nella sua politica nel senso di un avvicinamento verso i comunisti e verso il marxismo. Ciò determina il progressivo allontanamento da GL di elementi come Salvemini, Caffi, Tarchiani e, per ragioni diverse, dello stesso Lussu.
Per Rosselli diventa, a partire da quell’anno, importante l'unità proletaria, «una necessità indeclinabile», e per abbattere il fascismo propone di unire proletariato e borghesia in una coalizione liberalsocialista.
Nel '36 GL si schiera da subito al fianco del fronte popolare in Spagna.
La risposta dell'emigrazione e dell'antifascismo italiano non si fa attendere. Rosselli è alla testa di una colonna di esuli antifascisti (anarchici, giellisti, socialisti e comunisti), sul fronte di Aragona, ed era sicuro che questa esperienza avrebbe condotto alla certezza di poter vincere anche in Italia.
Celebre la sua frase, che diviene un vero e proprio motto «Oggi in Spagna, domani in Italia».
La vittoria della colonna italiana contro i franchisti, nella battaglia di Monte Pelato, fa il giro del mondo.
Ferito, è costretto a rientrare in Francia per curarsi e a lasciare il comando della colonna. Ma poco dopo il suo rientro in Francia Carlo Rosselli venne ucciso, assieme al fratello Nello, il 9 giugno 1937 a Bagnoles de l'Orne, in Francia, da alcuni sicari mandati da Mussolini.